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滿滿的干貨(三):質(zhì)粒DNA的提取,困難解決了嗎?

更新時間:2025-10-22點(diǎn)擊次數(shù):52

綜合前兩期的“滿滿的干貨(一)"和“滿滿的干貨(二)",大家對于質(zhì)粒DNA的提取應(yīng)該會有一定程度的了解,那么在使用過程中,很多人覺得自己提取的質(zhì)粒效果還是很差,究竟是怎么回事呢?

本期給大家在準(zhǔn)備了一些質(zhì)粒DNA提取時需要注意的事項(xiàng),這些結(jié)果包含了濃度偏高或低的原因及解決方案:

原因及解決方案

01質(zhì)粒濃度偏高

存在RNA殘留:未充分消化RNA(RNase A失效或未添加),導(dǎo)致A260值虛高。

解決方案

提取前一定要在溶液Ⅰ中加入RNase A,如果已加完RNase A的溶液Ⅰ在冰箱放置久了,一定要補(bǔ)加RNase A。

02細(xì)菌培養(yǎng)狀態(tài)不佳

  • 細(xì)菌密度過低:若細(xì)菌培養(yǎng)液OD值(如OD600)未達(dá)到對數(shù)生長期后期(通常1.0-1.5),菌體數(shù)量不足,會直接導(dǎo)致質(zhì)粒總量減少。

  • 培養(yǎng)時間過長:超過對數(shù)生長期后,細(xì)菌進(jìn)入穩(wěn)定期或衰退期,可能釋放核酸酶降解質(zhì)粒,同時菌體裂解難度增加。

  • 細(xì)菌污染,若培養(yǎng)液中混入雜菌,雜菌會爭奪營養(yǎng),導(dǎo)致目標(biāo)細(xì)菌生長受抑,同時可能釋放酶類破壞質(zhì)粒。

  • 菌液長期存放。

解決方案

(1)調(diào)整培養(yǎng)時間至12-16小時,但避免過度生長導(dǎo)致質(zhì)粒丟失。

(2)確保使用合適的培養(yǎng)基(如LB)和正確的抗生素濃度。

(3)接種前用新鮮活化的單菌落,避免使用陳舊或多次傳代的菌液。

03質(zhì)粒拷貝數(shù)低

  • 某些質(zhì)粒(如大質(zhì)?;虻涂截愘|(zhì)粒)天然拷貝數(shù)低(如pBR322為低拷貝)。

  • 插入片段過大(>10kb)導(dǎo)致復(fù)制效率下降。

解決方案

(1)選擇高拷貝質(zhì)粒載體。

(2)若需保留低拷貝質(zhì)粒,可增加培養(yǎng)體積(如從5mL增至10-20mL),提高質(zhì)??偭?。

04質(zhì)粒降解

在提取過程中,如果操作環(huán)境存在核酸酶(如DNase、RNase),或者提取過程中劇烈震蕩、溫度變化過大等,可能會導(dǎo)致質(zhì)粒降解,使提取的質(zhì)粒濃度降低。

解決方案

(1)在提取過程中,使用無核酸酶的試劑和耗材,如無核酸酶的水、無核酸酶的離心管等。

(2)操作時動作要輕柔,避免劇烈震蕩。嚴(yán)格控制溫度,尤其是在裂解和洗脫等關(guān)鍵步驟。


原因及解決方案

05裂解不充分

菌液量過多。

堿裂解(Solution II)時間過短:無法充分破壞細(xì)菌細(xì)胞膜和釋放質(zhì)粒;時間過長(超過5分鐘):會導(dǎo)致基因組DNA斷裂并與質(zhì)粒共沉淀,同時強(qiáng)堿可能降解質(zhì)粒。

裂解液未混勻。

解決方案

(1)采用適量的菌液量進(jìn)行提取。

(2)確保充分裂解,但時間不要超過5分鐘。

(3)加完Solution II一定要輕柔且充分混勻。

06中和與離心不充分

  • Solution III未充分混勻,質(zhì)粒復(fù)性不充分;

  • 離心轉(zhuǎn)速/時間不足(如<12,000rpm或<10分鐘),沉淀未分離。

解決方案

(1)加入Solution III后,立即顛倒混勻8-10次,直至出現(xiàn)均勻白色絮狀沉淀。

(2)12,000-13,000rpm離心10-15分鐘,確保沉淀充分。

07洗脫液使用不當(dāng)

  • 洗脫液體積過大。

  • 洗脫液pH不合適。

  • 洗脫溫度不足:未將洗脫液預(yù)熱至60℃左右,低溫會降低質(zhì)粒從硅膠膜上的解離效率。

  • 加完洗脫液未靜置直接離心。

解決方案

(1)洗脫時調(diào)整洗脫液添加體積,洗脫液體積過大會稀釋濃度;體積過小則無法充分濕潤硅膠膜,導(dǎo)致質(zhì)粒洗脫不充分。

(2)洗脫液(ddH2O或TE緩沖液)pH偏酸性(<7.0)會降低質(zhì)粒溶解度,影響洗脫效率,建議pH8.0-8.5。

(3)洗脫液加入后需靜置1-2分鐘,質(zhì)粒充分溶解并釋放后再離心。


08操作損耗

  • 離心后上清未充分吸棄,稀釋菌體。

  • 重懸緩沖液(Solution I)未充分混勻,菌體沉淀未分散。

解決方案

(1)菌體離心后,用移液器充分吸盡上清(殘留量<10μL)。

(2)加入Solution I后,用渦旋儀或移液器反復(fù)吹打至沉淀充分分散(無可見顆粒)。


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名稱

D1100

質(zhì)粒小量提取試劑盒

D1110

質(zhì)粒大量提取試劑盒

D1120

革蘭氏陽性菌質(zhì)粒小量提取試劑盒

D1130

革蘭氏陽性菌質(zhì)粒大量提取試劑盒

D1140

去內(nèi)毒素質(zhì)粒小量提取試劑盒

D1150

去內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒

D1160

酵母質(zhì)粒小量提取試劑盒

DM1100

質(zhì)粒小量提取試劑盒(磁珠法)


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