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Solarbio-酵母質(zhì)粒小量提取試劑盒 

產(chǎn)品簡介：試劑盒采用酶法破碎酵母細胞壁和堿裂解法裂解酵母細胞來提取酵母質(zhì)粒 DNA。所采用的酵母破壁酶能有效地破壞酵母細胞壁，提高酵母質(zhì)粒 DNA 的產(chǎn)量。吸附柱中采用的硅基質(zhì)材料能高效、專一地吸附 DNA，可限度去除雜質(zhì)蛋白質(zhì)及細胞中其他有機化合物。使用本試劑盒提取的酵母質(zhì)粒 DNA 可適用于各種常規(guī)的分子生物學(xué)實驗，包括酶切、PCR、測序、連接和轉(zhuǎn)化等試驗。本試劑盒無需使用酚等有毒試劑，操作安全。操作步驟： 1、取 1-5ml 酵母培養(yǎng)物（不超過 5×107 cells），12000rpm 離心 1min，盡量吸除上清（菌液較多時可以通過多次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中）。 2、酵母細胞壁的破除： A、酶法：向酵母菌體中加入 470ul 山梨醇 Buffer，充分懸浮菌體，加入 25ul 酵母破壁酶和 5ul 巰基還原劑，充分混勻，30℃處理 1-2h，期間可顛倒離心管混勻數(shù)次。12000rpm 離心 1min，棄上清，收集沉淀。向沉淀中加入 250ulYP1（請先檢查是否已加入 RNaseA），充分懸浮沉淀。注意：如果菌塊未*混勻，會影響裂解導(dǎo)致質(zhì)粒提取量和純度偏低。  B、玻璃珠法：向酵母菌體中加入 250ul YP 1（請先檢查是否已加入 RNaseA），充分懸浮沉淀。加入 150-200ul 酸洗玻璃珠（自備），漩渦振蕩 10min。簡短離心使玻璃珠沉降到離心管底，吸取上清（如上清有所損失，請用 YP 1 補足 250ul）于另一干凈離心管中。 3、向離心管中加入 250ul YP2，溫和地上下翻轉(zhuǎn) 6-8 次使菌體充分裂解。注意：混勻一定要溫和，以免污染細菌基因組 DNA，此時菌液應(yīng)變得清亮粘稠，作用時間不要超過 5 min，以免質(zhì)粒受到破壞。 4、向離心管中加入 350ul YP3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn) 6-8 次，充分混勻，此時會出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12000rpm 離心 10 min，用移液器小心地將上清轉(zhuǎn)移到另一個干凈的離心管中，盡量不要吸出沉淀。注意：YP3 加入后應(yīng)立即混合，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。 5、將上一步所得上清液加入吸附柱中，室溫放置 2min，12000rpm 離心 1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。 6、向吸附柱中加入 600ul 漂洗液(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12000rpm 離心 1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。 7、向吸附柱中加入 600ul 漂洗液，12000rpm 離心 1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。 8、12000rpm 離心 2min，將吸附柱敞口置于室溫或 50℃溫箱放置數(shù)分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，否則漂洗液中的乙醇會影響后續(xù)的實驗如酶切、PCR 等。 9、將吸附柱放入一個干凈的離心管中，向吸附膜中央懸空滴加 50-200ul 經(jīng) 65℃水浴預(yù)熱的洗脫液，室溫放置 2min， 12000rpm 離心 1min。 10、為了增加質(zhì)粒的回收效率，可將得到的洗脫液重新加入吸附柱中，室溫放置 2min，12000rpm 離心 1min。

Solarbio-酵母質(zhì)粒小量提取試劑盒

注意事項：

1、使用前請先檢查 YP2 和 YP3 是否出現(xiàn)混濁，如有混濁現(xiàn)象，可在 37℃水浴中加熱幾分鐘，待溶液恢復(fù)澄清后再使用。 2、洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于 50ul，體積過小影響回收效率；洗脫液的 pH 值對洗脫效率也有影響，若需要用水做洗脫液應(yīng)保證其 pH 值在 8.0 左右(可用 NaOH 將水的 pH 值調(diào)此范圍)，pH 值低于 7.0 會降低洗脫效率；DNA 產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防 DNA 降解。 3、質(zhì)粒得率與酵母菌株、質(zhì)粒拷貝數(shù)、培養(yǎng)條件等因素有關(guān)。通常酵母質(zhì)?？截悢?shù)都很低，一般通過電泳或分光光度計法都很難檢測到，可通過 PCR 或轉(zhuǎn)化大腸桿菌來檢測。 4、DNA 濃度及純度檢測：得到的基因組 DNA 片段的大小與樣品保存時間、操作過程中的剪切力等因素有關(guān)。回收得到的 DNA 片段可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。DNA 應(yīng)在 OD260 處有顯著吸收峰， OD260 值為 1 相當(dāng)于大約 50 μg/ml 雙鏈 DNA、40 μg/ml 單鏈 DNA。OD260/OD280 比值應(yīng)為 1.7-1.9，如果洗脫時不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水，比值會偏低，因為 pH 值和離子存在會影響光吸收值，但并不表示純度低。