鬼筆環(huán)肽-AMCA標(biāo)記探針會選擇性地結(jié)合F-肌動蛋白。以納摩爾濃度使用，鬼筆環(huán)肽衍生物是方便的探針，用于標(biāo)記，鑒定和定量甲醛固定和透化組織切片中的F-肌動蛋白，細(xì)胞培養(yǎng)物或無細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。肌動蛋白是一種球狀的，大約42kDa的蛋白質(zhì)，幾乎存在于所有真核細(xì)胞中。 它也是高度保守的蛋白質(zhì)之一，與藻類和人類不同的物種相差不超過20％。 肌動蛋白是細(xì)胞中兩種細(xì)絲的單體亞基：微絲，細(xì)胞骨架的三個主要組分之一，以及微絲，是肌細(xì)胞中收縮裝置的一部分。 因此，肌動蛋白參與許多重要的細(xì)胞過程，包括肌肉收縮，細(xì)胞運(yùn)動，細(xì)胞分裂和胞質(zhì)分裂，囊泡和細(xì)胞器運(yùn)動，細(xì)胞信號傳導(dǎo)，以及細(xì)胞連接和細(xì)胞形狀的建立和維持。

鬼筆環(huán)肽比肌動蛋白單體更緊密地結(jié)合肌動蛋白絲，導(dǎo)致肌動蛋白亞基從絲狀末端解離的速率常數(shù)降低，基本上通過防止絲解聚來穩(wěn)定肌動蛋白絲。此外，發(fā)現(xiàn)鬼筆環(huán)肽抑制F-肌動蛋白的ATP水解活性。鬼筆環(huán)肽在細(xì)胞中以不同濃度起作用不同。當(dāng)以低濃度引入細(xì)胞質(zhì)時，鬼筆環(huán)肽將較少聚合形式的細(xì)胞質(zhì)肌動蛋白以及微絲蛋白聚集成聚集的肌動蛋白聚合物的穩(wěn)定“島"，但它不會干擾應(yīng)力纖維，即厚的微絲束。鬼筆環(huán)肽的性質(zhì)是通過用熒光類似物標(biāo)記鬼筆環(huán)肽并用它們?nèi)旧拥鞍捉z用于光學(xué)顯微鏡來研究F-肌動蛋白在細(xì)胞中的分布的有用工具。鬼筆環(huán)肽的熒光衍生物已經(jīng)證明在定位活細(xì)胞或固定細(xì)胞中的肌動蛋白絲以及在體外可視化單個肌動蛋白絲方面非常有用。熒光鬼筆環(huán)肽衍生物已被用作高分辨率肌動蛋白研究中的重要工具。

標(biāo)記，鑒定和定量甲醛固定和透化組織切片中的F-肌動蛋白，細(xì)胞培養(yǎng)物或無細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.將 1 μL 的鬼筆環(huán)肽-AMCA 綴合物溶液添加到 1 mL 含 1% BSA的PBS 中。

注意1：鬼筆環(huán)肽綴合物的未使用的儲備溶液應(yīng)等分并儲存在-20℃，避光。

注意2：不同的細(xì)胞類型可能染色不同。 應(yīng)相應(yīng)地制備鬼筆環(huán)肽綴合物工作溶液的濃度。

2.染色細(xì)胞：

2.1執(zhí)行甲醛固定。 在室溫下將含3.0-4.0％甲醛的細(xì)胞在PBS中孵育10-30分鐘。

注意：避免使用任何含甲醇的固定劑，因?yàn)榧状紩诠潭ㄟ^程中破壞肌動蛋白。 優(yōu)選的固定劑是不含甲醇的甲醛。

2.2用PBS沖洗固定的細(xì)胞2-3次。

2.3可選：在PBS中加入0.1％Triton X-100固定細(xì)胞3至5分鐘，以增加滲透性。 用PBS沖洗細(xì)胞2-3次。

2.4將100μL/孔（96孔板）鬼筆環(huán)肽綴合物工作溶液加入固定的細(xì)胞，并在室溫下染色細(xì)胞20至90分鐘。

2.5在加上蓋玻片之前，用PBS輕輕沖洗細(xì)胞2至3次以除去過量的鬼筆環(huán)肽綴合物，然后在顯微鏡下進(jìn)行，密封和成像。

在微孔板孔中制備樣品

從板中的樣品中取出液體

添加鬼筆環(huán)肽-AMCA溶液（100μL/孔）

在室溫下染色細(xì)胞20至90分鐘

清洗細(xì)胞在顯微鏡下檢查樣品

注意：將小瓶加熱至室溫并在打開前短暫離心

鬼筆環(huán)肽-AMCA標(biāo)記

鬼筆環(huán)肽-AMCA標(biāo)記